夹心法ELISA操作步骤

1  分别设定标准孔、0孔和样本孔，计算好当次试验所需要的板条数量，将不需要的板条拆卸下来，用新的封板膜重新封好，放回装有干燥剂的铝箔袋。

2  浸泡酶标板：加入300 μL 1×洗涤液静置浸泡30秒，弃掉洗涤液之后，在吸水纸上将微孔板拍干，重复2次。

提示：洗板完成之后，请立即使用微孔板，不要让微孔板干燥。

3  加标准品：标准品孔加入100 μL的2倍倍比稀释的标准品。0孔加入100 μL标准品/样本稀释液。

4  加样本：样本孔加入100 μL的待测样本。保证连续加样，不要间断。加样过程在10 min内完成。

5  孵育：使用新的封板膜封板。37℃静置孵育90 min。

6  洗涤：弃掉液体，每孔加入300 μL洗液洗板，洗涤4次。每次洗板，在吸水纸上拍干。

提示：为获得理想的实验结果，必须干净移除残留液体。洗板完成之后，请立即进行下步操作，不要让微孔板干燥。

7  加生物素化检测抗体：加入100 μL生物素化抗体工作液至反应孔中。

8  孵育：使用新的封板膜封板。37℃静置孵育60 min。

9  洗涤：弃掉液体，每孔加入300 μL洗液洗板，洗涤4次。每次洗板，在吸水纸上拍干。

提示：为获得理想的实验结果，必须干净移除残留液体。洗板完成之后，请立即进行下步操作，不要让微孔板干燥。

10  加酶结合物：加入100 μL酶结合物工作液至反应孔中。

11  孵育：使用新的封板膜封板。封板后于37℃静置孵育30 min。

12  洗涤：弃掉液体，每孔加入300 μL洗液洗板，洗涤5次。每次洗板，在吸水纸上拍干。

提示：为获得理想的实验结果，必须干净移除残留液体。洗板完成之后，请立即进行下步操作，不要让微孔板干燥。

13  加底物显色：每孔加入100 μL显色底物TMB，避光，37℃避光显色15 min。

提示：可根据实际显色情况酌情缩短或延长显色时间，但不可超过30 min。当标准孔颜色出现明显梯度时（标准孔的前4孔出现明显的蓝色梯度，后3~4孔不明显），即可终止。提前15 min打开酶标仪预热。

14  加终止液：每孔加入50 μL终止液，终止液加入的顺序应尽量与显色底物加入的顺序相同。

提示：终止液加入后微孔板内液体的颜色由蓝色变为黄色。如果颜色呈现绿色或者颜色的变化明显不均匀，请轻轻叩击板框，水平充分混匀。

15  检测读数：在5 min之内，使用酶标仪进行双波长检测，测定450 nm最大吸收波长和630 nm参考波长下的OD值。

提示：校准后的OD值为450 nm的测定值减去630 nm的测定值。（注：630 nm OD值为酶标板材质吸收值。若不能进行双波长检测，可只测定450 nm波长下的OD值，但数据的准确度会降低一些）