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氨基酸衍生化试剂盒(PITC法,不含标准品)
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    龚思雨

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    试剂、实验室仪器 / 设备、耗材、技术服务

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建议收藏:生化试剂盒常见问题汇总

11311 人阅读发布时间:2021-04-29 09:45

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1. 
生化试剂盒的测定原理?


生化试剂盒通过化学反应/酶促反应或物质结构特点测定样本中物质含量或酶活;所用仪器一般为分光光度计和酶标仪,两者的测定原理都是朗伯比耳定律: A=kbc,即当适当波长的一束平行单色光照射固定浓度均匀溶液时,其吸光度与光通过的液层厚度成正比。土壤、水质、动植物组织、血清、细胞细菌、食品等样本均可以进行测定。

2. 如何选择不同规格的试剂盒?

(首先根据本实验的实际情况选择,实验室有酶标仪的且有该检测波长的可以选择微量法试剂盒;实验室有分光光度计的,且有相应规格的比色皿既可以选择常量法也可选择微量法试剂盒。建议购买前先阅读官网的说明书,对其中自备的仪器和试剂进行确认。


3. 收到试剂盒后如何保存?

如果收到试剂盒,暂时不用,可按照外包装上指示的温度统一保存;拆开包装后,请按照每个试剂的保存温度进行保存,有些试剂忌反复冻融;有些试剂为粉剂,溶解之后性质不稳定。


4. 试剂盒的有效期是多长?

通常对于转染效率非常高的细胞,我们建议用没有 TA promoter 的质粒;对于转染效率比较低的细胞,我们建议使用带有 TA promoter 的质粒。带有 TA promoter 的质粒,由于多了一段启动子,本底性的表达就会比较高,在转染效率比较低的情况下也比较容易检测到。而没有 TA promoter 的质粒,本底性表达相对比较低,如果转染效率比较低,就很可能检测起来有困难。但对于转染效率比较高的细胞,由于没有 TA promoter 的质粒的本底比较低,有时更容易观察到报告基因的变化或差异。具体选用何种质粒效果更好,还要视具体的实验条件而定。


5. 收到试剂盒后应该从哪一步做起?

强烈建议客户先拿出 2-3 个预期结果差别较大的样本做预实验。在实验的过程中,首先将试剂盒中的说明书通读一遍,检查试剂盒中各成分的量与说明书符不符合,溶解或使部分试剂回复至室温,然后处理样本,样本提取完成后,再溶解一些粉剂,开始实验。


5. 试剂盒中含有干粉的试剂应该怎么稀释保存?

一般试剂为粉剂的,可能更多的考虑到配成溶液后的稳定性差,如 NADH,或者和其他试剂溶解在一起会在不同的温度下有其他的化学反应如氯化锰。-20℃ 保存的粉剂建议溶解后分装保存,避免反复冻融。


6. 买了多个试剂盒,样本只有很少可以只用一种提取液提取吗?

一般同一个系列的试剂盒中,酶活测定的提取液类似,含量测定的提取液类似。但具体的请具体查询。


7. 待测样本必须是鲜样的吗?冷冻样本是否可以用?

新鲜样本和冷冻样本都可用于大多数指标的测定,有一些生理活性物质容易降解,建议用新鲜样本测定,如辅酶 Ⅰ、辅酶 Ⅱ、谷胱甘肽、线粒体复合体等。冷冻样本建议在 -70℃ 或者液氮中保存。一般样本在 4 度能都保存一周,-20 保存一个月,-80 保存 3 个月

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8. 土壤酶活性测定可以用鲜土吗?

由于土壤颗粒大小不一致导致水分含量不一样,且取样量较少,为了保证测定的重复性,建议将鲜土风干并过筛后取样。若用鲜土测定,需保证样本的颗粒大小一致水分含量相似,建议过 40 目筛后取样,且同时测定的样本要保持一致,最好不要一组样本用风干土,一组用鲜土,风干后的土样在 -20 保存 1 个月测定大部分酶活几乎不会有损失;某些土壤的成分如硝态氮、铵态氮等在风干过程中会发生显著变化,必须用新鲜样品进行分析。


9. 样本研磨的方法?

样本研磨我们一般用到三种方法:
第一种:将研钵置于冰盒上匀浆即冰浴匀浆,在匀浆的过程中注意匀浆器浸于冰中,防止因为摩擦引起的温度过高,提取液可以在匀浆过程中或者匀浆后加入。
第二种:用液氮匀浆,液氮研磨前将样本洗净,尽量剪成小块,放入研钵中,加入液氮研磨,液氮挥散后尽快加入第二次液氮直至研磨成粉末状,避免其过程中反复冻融,同时要做好保护措施,防止冻伤手指。完成后将粉末收集到离心管中加入缓冲液。样本可以提前称量号也可研磨完后称量。
第三种:使用匀浆机进行匀浆,将称好的组织放入离心管中,加入适量提取液,加入钢珠。并将模块提前遇冷,按照机器指示进行操作。一般的动物组织用该方法效果尚可,有些机器对植物组织的处理效果不好。


10. 测定前是如何调零?

使用分光光度计的用户,用蒸馏水或相应的有机试剂直接调零。使用酶标仪的用户,可以在一个孔里加入 200μL 的蒸馏水或去离子水,作为调零孔,也可不用调零,后续计算中会有空白孔。


11. 样本如何稀释或浓缩?

样本测定值若超出检测范围,可以将提取的上清液用提取液稀释后重新测定。一般从高到低,按照 2 倍,5 倍,10 倍,20 倍的顺序,选择一个合适的稀释倍数。样本测定值若低于检测范围,可以提高样本浓度,如称取 0.2g 样本加入 1mL 提取液匀浆,相当于将样本浓缩 2 倍。


12. 如何保证测定温度?

(1)根据说明书中指定测定温度,提前打开保温设备(如水浴锅),设到指定温度,在达到指定温度后,把冷藏的试剂转移到保温设备中保温10-30分钟以上,以保证反应一开始,就在指定温度中进行。

(2)对于拥有酶标仪的用户,直接提前预热,在达到设定温度后,可以直接把预热后的试剂,加入酶标板,然后开始反应。

(3)在保温设备(水浴锅和金属浴,最好是前者)进行。注意提前对保温设备进行预热,达到设定温度后再进行反应。但是仅适用于能够终止的反应。

(4)对于瞬间完成的反应,或者对温度不敏感的反应,为了提高重复性,最好在同一温度下完成检测。例如打开空调,设定在室温,如 25℃。 当然,所有控温设备,都要进行预热。


13. 试剂盒有哪些常见规格?

(1)50 管的试剂盒,常量法试剂盒,用分光光度计检测。1mL 的比色皿检测。
(2)100 管的试剂盒,微量法试剂盒,用酶标仪(酶标板)或者分光光度计(0.25 mL 比色皿)检测。


14. 试剂盒规格中是什么意思?

(1)50T/48S:50T 指能够做 50 次测定,48S 指可以测试 48 个样品。如果每个样品重复测定 3 次,那么只能测定 16 个样品。其中有 2 次测定用于空白管或者对照管。值得特别注意的是,50T/24S 中由于每个样品测定都需要做对照,因此能够测定样品的数量仅为 8 个(假设做 3 次重复)
(2)100T/96S:100T 指能够做 100 次测定,96S 指可以测定 96 个样品,如果每个样品重复测定 3 次,那么只能测定 32 个样品。其中有 4 次测定用于空白管或者对照管。 注意由于瓶璧和移液器吸附等,通常要比理论测定次数少 1~3 次。其它规格的含义依次类推。值得特别注意的是,100T/48S 中由于每个样品测定都需要做对照,因此能够测定样品的数量仅为 16 个(假设做 3 次重复)。

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15. 常量法和微量法试剂盒能否通用?

同一指标的常量法与微量法试剂盒不可以通用,因为两者测定体系不同。如果用户自行改变体系,公司不能保证测定质量。


16. 比色皿有哪些规格?

(1)常量比色皿,如 1mL 和 3mL 等,常量法试剂盒都是选用 1mL 体系,只能用 1mL 比色皿,不可以用更大体积的比色皿,否则试剂量不够,无法正常比色。如果用户需要,自行购买公司的 1mL 比色皿。
(2)微量比色皿,如 0.25mL 和 0.5mL 等,微量法试剂盒都是选用 0.25mL 比色皿。如果用户需要,自行购买公司的 0.25mL 比色皿。一般客户都选择使用酶标仪(需要自备酶标板)。
(3)紫外波长检测需要石英比色皿,不可以用普通玻璃比色皿。
(4)不同规格的比色皿,其外观大小是一致的,都是 1cm 光径(也有 0.5cm 光径的比色皿,不常见,也可以用,但是计算时要注意修改计算公式),其内容积差异在于壁的厚度。


17. UV  板和普通酶标板有何区别?

(1)微量法一般使用酶标板,当检测波长≥380nm 时,用一般的酶标板即可,价格便宜,一次性使用当然也可以用 UV 板代替,只是有些浪费。当检测波长<380nm 时,须选用区别于一般酶标板的 UV 酶标板。价格比普通的酶标板贵,但可用洗板机清洗,重复利用。货号 YA0602 96 孔 UV 紫外检测酶标板(未灭菌)
(2)最终测定的反应液为有机试剂时,避免使用聚苯材质的 96 孔板。


18. 为什么有些试剂盒不提供标准品?

(1)这个根据最后酶活定义来决定的,能提供的尽量提供,有些酶活测定的试剂盒,这种酶本身就很难获得。
(2)有些检测对象本身就无法购买到标准品。


19. 试剂盒应该在多长时间内用完?

(1)为了保证测定质量,试剂盒开封后一般应该在一个月内用完。
(2)用户样品量大时,可以一次订购,分批生产和发货。
(3)特别值得注意的是,出于试剂稳定性考虑,说明书特别标明现配现用的试剂,配制后应该短时间内用完(如 2 小时),绝对不可以过夜。
(4)为了用户方便,公司通常分装成几个试剂瓶中,用户可以根据实际测定需要,进行配制。


20. 按照说明书冷藏后出现沉淀的试剂还可以用吗?

可以。但是应该在常温中充分溶解后再用,以免试剂浓度变小,造成测定不可靠。


21. 试剂变色后还可以用吗?

不可以。建议用户注意避光保存,使用前一定要观察试剂颜色是否正常。

 
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22. 可以改变说明书中加试剂顺序吗?

不可以,否则可能造成反应不能正常进行,导致测定失败。强烈建议加完试剂后立即混匀。


23. 加完试剂后是如何振荡混匀的?

使用分光光度计的用户,可以将反应液加在离心管里,通过手动混匀或用涡旋振荡器混匀后马上转移到比色皿中检测,也可以将试剂放在比色皿中,迅速换成 0.2ml 的移液枪混匀。使用酶标仪的用户,可以将酶标仪在测定开始前设置一个 5 秒钟的振荡程序。


24. 为什么吸光度特别高?

(1)现在分光光度计或者酶标仪,允许测定的吸光度有一定的范围。
(2)吸光度特别高,导致吸光度变化不再符合朗伯比尔定律,同时灵敏度也会降低。
(3)吸光度特别高,可能因为样品提取液在该波长下有其它强烈吸收的物质,添加的底物浓度高,紫外波长下用的玻璃比色皿,或者普通酶标板,比色皿脏,者比色皿不透光一面对着光源等。


25. 试剂盒中 -20 度保存的干粉溶解后如何保存?

建议溶解后分装冻存,防止反复冻融。试剂盒开封后建议 2 周内用完。


26. 标签上写着放 4 度保存,不小心放在了 -20 度,还能用吗?

一般情况拿出来放 4 度,没有析出的情况下是可以使用的,但是有的试剂写着切记放-20 度,这种情况下是不能使用的。所以建议客户收到产品后先详细的看一下说明书。


27. 如何选择比色皿或者 96 孔板

波长小于 380nm 的为紫外光区,需要用石英比色皿或者 96 孔 UV 板检测;波长大于 380nm 的为可见光区,不论石英或者玻璃比色皿、96 孔板均可检测。但若最终测定的反应液为有机试剂时,避免使用聚苯材质的 96 孔板。


28. 测定时间段的试剂盒的注意事项

(1)测定时间短:建议使用比色皿或者 96 孔板一个一个进行测量,加完所有试剂后快速混匀(使用微量比色皿一定要将枪头插至比色皿底部进行混匀操作)进行测量,如测定多个样本可以在加完最后一个试剂后开始计时,混匀固定时间(10s、20s)再进行测量
(2)测定时间长(10min、30min):微量法可以使用 96 孔板进行测量,可以使用排枪加入同样的试剂。测定的每一列样本可以错开时间进行测量以保证数据的准确性,防止一次测量过多样本使起始反应时间不同而导致数据不准确。

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