大家好，上次我们介绍了细胞培养需要的实验室条件和实验前准备工作及注意事项。这些知识和小技巧以及小细节都掌握了吗？今天，小编带大家学习细胞培养的基本操作步骤和操作要领，助您细胞培养实验事半功倍。 

细胞的复苏与冻存

细胞复苏

将细胞从液氮中取出后，放到 37℃水浴锅中进行快速解冻，边解冻边轻微摇晃。

确定冻存管中的细胞解冻完全后，放到水平离心机中离心，1000rpm 离心 2min。

小心吸掉上清，加入 500µL 培养基重悬细胞。

一般情况下，T75 培养瓶中加 10mL 的培养基，将细胞加入到已加培养基的培养瓶中。轻轻摇晃培养瓶使细胞均匀分布，放到细胞培养箱中培养。


细胞冻存

从培养箱中取出细胞，观察细胞的生长状态是否良好，并观察细胞的增殖数量。细胞要生长到一定密度再进行冻存。

悬浮细胞不用消化，将细胞轻轻吹散，吸到离心管中离心，1000rpm 离心 3-5min。不同的细胞要用不同的力度，不然会损伤细胞。

贴壁细胞要进行消化，消化完成后，吸到离心管中离心，1000rpm 离心 3-5min。

培养基重悬细胞进行细胞计数，冻存密度在 5×106-1×107/mL 之间。

按照比例加入 10% 的 DMSO，小心重悬细胞，细胞和 DMSO 充分混匀。或直接用细胞冻存液进行冻存。将细胞加入到冻存管中，每管 1mL。

将冻存管放到冻存盒中进行梯度降温，最后转移到液氮中保存。


悬浮细胞培养

悬浮细胞有的结团生长，需要经常观察细胞状态。

每次传代都要将细胞团吹打成单个细胞，吸到离心管中离心，1000rpm 离心 3-5min。

弃上清，重悬细胞。根据细胞生长速度取 2×105-5×105 个细胞进行传代培养。


贴壁细胞培养

细胞复苏

小心吸掉上清，加入 2mL PBS，晃动培养瓶，洗掉多余培养基。

加入 2mL 胰酶，放到培养箱中消化 1-2min，轻拍培养瓶见细胞像沙粒样散落，立即加入 2mL 含血清培养基终止消化，并用移液器吹打细胞，使细胞单个散落。吸到离心管中离心，1000rpm 离心 3-5min。

弃上清，重悬细胞。根据细胞生长速度取 2×105-5×105 个细胞进行传代培养。


半悬浮（半贴壁）细胞培养

半悬浮细胞就是不完全贴壁，上清中也有细胞。

需要将上清收集到离心管中离心，1000rpm 离心 3-5min。

重复贴壁细胞的操作，然后将上清中的细胞和消化下来的细胞重悬到一起再进行传代培养。

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