缺氧是实体瘤最常见的标志之一，常导致多药耐药性（MDR），进一步导致化疗失败。肿瘤转移是大多数癌症患者死亡的主要原因。而缺氧已被证明可促进上皮间质转化（EMT），从而加速转移。因此，通过向肿瘤组织输送氧气来缓解缺氧应该是抑制MDR和肿瘤转移的有效途径。在各种供氧材料中，全氟碳化合物（PFCs）因其极高的氧溶解度和良好的生物相容性而具有卓越的优势，已得到广泛应用。然而，PFC仅通过氧浓度梯度扩散释放氧气。为了增强缓解肿瘤缺氧的效果，需要通过外部刺激来触发PFCs释放氧气。高强度聚焦超声（HIFU）是一种临床使用的无创热疗消融技术，可以精确控制和提高目标组织的温度。其中，温和的温度介导的HIFU（M-HIFU）仅略微升高靶组织的温度（<43°C）。因此，利用M-HIFU触发PFC释放氧可能比正常超声更好地缓解肿瘤缺氧。

      由于化疗药物疗效有限且副作用严重，稳定的载药量对于基于PCF的药物给药系统（DDS）避免药物在血液中过早释放至关重要。以往的研究主要是用磷脂或其他表面活性剂、白蛋白、红细胞膜、空心Bi₂Se₃和二氧化硅纳米颗粒包覆PFC，然而，这些系统往往受到复杂的制造和装载剂有限的稳定性影响。因此，开发具有高稳定性和易于构建的基于PFC的DDS对于实际应用具有重要意义。硅质体是一种结合脂质体和二氧化硅纳米粒子优点的仿生纳米混合体。硅质体可以在材料表面形成一层有机硅氧烷网络结构，显著增加结构和载药稳定性，使药物在体内的血液循环时间更长，肿瘤缺氧的改善程度更好，被认为是一种理想的药物载体。

      北京大学第三医院超声诊断科梁晓龙课题组开发了一种“抗缺氧全氟化碳硅质体纳米液滴—perfluorocarbon@cerasomes（PCs）”，用于共同输送氧气和化疗药物，实现了M-HIFU触发的超声成像和肿瘤原位氧和药物的协同释放。本研究中，作者选择三阴性乳腺癌作为肿瘤模型，选择阿霉素（DOX）作为模型药物。通过将var7的巯基与PCs的Maleimide偶联，制备了var7修饰PCs（vPCs）。M-HIFU和vPCs协同作用，可以大大减轻缺氧导致的MDR和EMT，提高药物疗效，减少副作用，从而显著抑制肿瘤的转移，展现出较好的临床应用前景。

 

  

基本信息

 

题目：

High Intensity Focused Ultrasound-Responsive and Ultrastable Cerasomal Perfluorocarbon Nanodroplets for Alleviating Tumor Multidrug Resistance and Epithelial–Mesenchymal Transition

期刊：ACS NANO

影响因子：14.588  

PMID：33175487

通讯作者：梁晓龙副研究员和王凡教授

作者单位：北医三院和北京大学

 

摘 要

      缺氧是大多数实体肿瘤的典型特征，常常导致多药耐药（MDR），并导致化疗失败。缺氧还可促进上皮-间充质转化（EMT），加速肿瘤转移。许多化疗药物可进一步加重缺氧，从而促进转移。因此，缓解缺氧是化疗抑制MDR和EMT的必要条件。本研究中，作者构建了一种具有聚有机硅氧烷表面原子层和pH敏感肿瘤靶向肽的超稳定全氟化碳硅质体纳米液滴（D-vPCs-O₂），用以实现氧气和阿霉素（DOX）在肿瘤区域的定点可控递送。利用HIFU触发DOX和氧气的共释放并同时增强超声成像，实现了成像引导下的药物递送。M-HIFU不仅触发了纳米液滴中的氧气释放，同时使肿瘤温度略微升高，加速肿瘤的血流灌注量，进一步改善肿瘤缺氧。由于硅质体超稳定的载药量，总体副作用也大大降低。化疗和缺氧的改善共同下调转化生长因子-β（TGF-β1）的表达量，导致EMT减轻，从而显著抑制肿瘤转移。当D-vPCs-O₂+M-HIFU被用作新辅助化疗时，显著下调热休克蛋白，从而减少高温HIFU（H-HIFU）介导的高温热消融后的肿瘤复发。化学热疗彻底根除了肿瘤，且无复发和转移，为恶性程度高、易转移、缺乏有效治疗手段的三阴性乳腺癌提供了一条有前途的治疗途径。

 

研究内容及结果

1. D-PFH-vPC具有良好的载药稳定性和超声成像增强能力

利用四种常用的PFCs（PFP、PFH、PFOB和PFCE）制备了四种D-vPCs；同时，D-VPL是利用正常磷脂代替硅质体制备的。通过冷冻蚀刻扫描电子显微镜对四种D-VPC的形态进行了表征（图1a），发现所有D-VPC均为球形，直径相对均匀。对纳米液滴的理化特性进行分析（图1b-h），结果显示：研究发现D-PFP-vPCs缺乏形态稳定性和载药稳定性；而D-PFOB-vPCs和D-PFCE-vPCs的DOX包封效率低、对M-HIFU触发的DOX释放反应速度慢、缺乏增强超声成像的能力。D-PFH-vPCs同时具有良好的稳定性和增强超声成像的能力。

                图1

2. vPCs-O₂+M-HIFU可以有效缓解体外缺氧介导的MDR和EMT

       作者首先检测vPCs的主动肿瘤靶向能力，在温和的酸性环境中用vPCs孵育细胞后的平均荧光强度是中性环境（pH7.2-7.4）中的2.5倍，显示了var7靶向酸性肿瘤环境的能力（图2a）。然后，检测了载氧vPCs对肿瘤缺氧状态的影响，结果显示：vPCs-O₂+M-HIFU与细胞共孵育后，缺氧的4T1细胞转化为较低的缺氧状态（图2b）；MDR相关基因如MDR1、HIF-1α和P-gp的表达量显著降低（图2c、d和e）。当用D-vPCs-O₂+M-HIFU处理细胞时，与D-vPCs-N₂+M-HIFU相比，DOX摄取增加了103.8%，细胞活力显著降低62.5％，细胞凋亡活性显著增加111.3％（图2f-h）。综上所述，D-vPCs-O₂+M-HIFU超声可以缓解肿瘤细胞缺氧状态，下调MDR相关基因和蛋白表达，增加细胞内DOX积累。

      进一步研究了D-vPCs-O₂+M-HIFU对EMT的影响。经vPCs-O₂+M-HIFU处理后，迁移和侵袭细胞数量分别显著减少70.8%和65.4%（图2i、j）。在D-vPCs-O₂+M-HIFU处理后，与D-vPCs-N₂+M-HIFU相比，迁移细胞和侵袭细胞的数量分别显著减少了67.0%和71.6%。ELISA定量EMT标记物的表达水平，结果如图2k所示，vPCs-O₂+M-HIFU显著下调缺氧细胞TGF-β1和EMT标记物如钙粘蛋白E、Vimentin和Twist的表达水平，而低浓度DOX显著上调其表达水平。D-vPCs-O₂+M-HIFU进一步下调已经上调的TGF-β1和EMT标记物。这表明vPCs-O₂+M-HIFU可有效抑制肿瘤细胞的EMT转化。

                    图2

3. 体内荧光成像、生物分布和M-HIFU介导的药物释放研究

     由于DOX不适用于活体成像，制备了Cy7-vPCs、Cy7-vPLs和Cy7-Doxil。静脉注射给单层4T1荷瘤BALB/c小鼠，体内荧光成像结果显示：Cy7-vPCs+M-HIFU的肿瘤荧光强度曲线下面积（AUC_0-72h）比Cy7-vPCs的升高4.6倍（图3a和b）；Cy7-vPCs+HIFU的AUC_0-72h比Cy7-PCs+HIFU的高1.7倍（图3a，b）。中和的肿瘤AUC_0-72h明显低于未处理的肿瘤，进一步显示了var7靶向酸性肿瘤微环境的能力。

    采用双侧异种移植瘤评估Cy7-vPCs和D-vPCs的M-HIFU反应性。如图3c所示，静脉注射后，仅用M-HIFU超声处理肿瘤的一侧。MDA-MB-231荷瘤BALB/c裸鼠（图3d）或4T1荷瘤鼠（图3e）注射游离Cy7、Cy7-vPCs或Cy7-Doxil。注射Cy7-vPCs后，经M-HIFU超声处理的一侧肿瘤的荧光明显高于未经超声处理的另一侧肿瘤。DOX（或Cy7）的生物分布显示：D-vPCs+M-HIFU处理后，明显增加了在肿瘤中的DOX累积；显著降低了心脏中的DOX蓄积（图3g-h）。

                                   图3

4. D-vPCs+M-HIFU可以有效缓解体内肿瘤缺氧，实现超声成像引导化疗

     在4T1荷瘤小鼠体内检测vPCs缓解肿瘤缺氧的效果，评估化疗的有效性。结果显示，M-HIFU超声联合高氧呼吸使肿瘤缺氧区域面积减小（图4a），降低了HIF-1α和P-gp的相对表达水平（图4b）。D-vPCs-O₂表现出较强的超声（US）成像，并最终在整个肿瘤区域实现高频信号扩散（图4c）。这个过程伴随着氧和DOX的释放。因此，M-HIFU响应性超声成像显示出监测D-vPC中氧和DOX释放的潜力，从而实现超声成像引导化疗。与其他实验组相比，D-vPCs+M-HIFU表现出更好的肿瘤生长抑制作用（P<0.05），肿瘤生长抑制率高达94.6%，实现了最高比例的凋亡（> 90%），并且肿瘤核被广泛破碎（图4d-g）。

                                                        图4

        同时，进一步详细研究了心脏损伤和骨髓抑制，因为它们是DOX的主要副作用。结果显示：与其他实验组相比，D-vPCs-O₂+M-HIFU处理后，DOX在心脏组织中的积累显著减少，DOX诱导心脏细胞的凋亡比例显著降低（图5a）。D-vPCs-O₂+M-HIFU组的肌酸激酶（CK）、乳酸脱氢酶（LDH）、白细胞（WBC）无明显变化（图5b-d），表明D-vPCs-O₂+M-HIFU副作用极小，不会造成严重的心脏损伤和骨髓抑制。

                                                   图5

5. vPCs-O₂+M-HIFU有效缓解EMT和抑制肺转移

       通过小鼠活体成像检查体内化疗后肺癌移植瘤转移。结果显示：PBS组小鼠均有自发性肺转移（图6a）。相较于PBS组，vPCs-O₂+M-HIFU组小鼠转移至肺表面的癌细胞数量和面积显著减少（图6b-c）。比较肿瘤EMT标记物EMT相关基因表达量的变化（图6d-h），表明vPCs-O₂+M-HIFU能显著缓解EMT。与D-vPCs+M-HIFU相比，D-vPCs-O₂+M-HIFU不仅缓解了肿瘤缺氧，而且降低了缺氧介导的MDR，而增强化疗在缓解EMT方面也可能具有协同作用。

                                              图6

6. D-vPCs-O₂+M-HIFU可以减少热疗消融后的肿瘤复发

      探究新辅助化疗与热疗联合治疗的合理性，体外研究结果显示：化疗-热疗联合治疗的抗癌效果均明显优于单独化疗或单独热疗（图7a）；同时，不管DOX浓度如何，协同作用依然明显存在（图7b）。在4T1荷瘤裸鼠中进一步进行联合治疗，发现PBS处理组经热疗消融后，所有肿瘤均快速复发（图 7cI，dI）。

     游离DOX或Doxil处理组经热疗消融后，复发肿瘤的百分比分别下降至 66.7% 和 50.0%（图7dII，III）。D-vPCs-O₂+M-HIFU处理组的抗肿瘤作用更强，在热疗后60天内未观察到肿瘤复发和肺转移（图7cⅣ，dⅣ）D-vPCs-O₂+M-HIFU的两次给药明显降低了HSP-27和HSP-90的表达水平（图7e），表明体内也存在协同效应。因此，D-vPCs-O₂+M-HIFU适合作为新型辅助化疗药物，从而减少热疗消融后的肿瘤复发。

                                        图7

 

结 论

       本研究中，作者成功制备了D-vPCs-O₂纳米液滴，实现了M-HIFU触发的药物和氧气在肿瘤区域内的定点可控递送。D-vPCs-O₂+M-HIFU可显著增加肿瘤内部的药物蓄积，从而更好的抑制肿瘤的生长。D-vPCs-O₂+M-HIFU还可使肿瘤缺氧大大缓解，MDR和EMT减轻，最终抑制肿瘤转移。通过将D-vPCs-O₂+M-HIFU和H-HIFU介导的高温消融术相结合，可以提高药物疗效，减少副作用，能更好地抑制肿瘤复发。同时，该纳米液滴具有良好的形态和超稳定的载药稳定性，可以延长血液循环时间，降低心脏损伤和骨髓抑制。综上所述，D-vPCs-O₂+ M-HIFU展现出巨大的临床应用潜力。

 

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