RT-PCR简介

RT-PCR简介： RT-PCR是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。首先经反转录酶的作用从RNA合成 cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。RT-PCR主要用于对表达信息进行检测或定量，分析基因的转录水平。另外，这项技术还可以用来检测基因表达差异或克隆cDNA而不必构建cDNA文库。RT-PCR比其他包括Northern印迹、RNase保护分析、原位杂交及S1核酸酶分析在内的RNA分析技术，更灵敏，更易于操作。 RT-PCR体系： 模板：作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。无论使用何种RNA，关键是确保RNA不降解并且无基因组DNA的污染。 引物：用于反转录的引物可视实验的具体情况选择随机引物、Oligo dT及基因特异性引物中的一种。对于短的不具有发卡结构的真核细胞mRNA，三种都可。 随机引物：适用于长的或具有发卡结构的RNA，特异性最低。经常用于获取5’末端序列或从带有二级结构区域的模板获得cDNA。为了获得最长的cDNA，需要按经验确定每个RNA样品中引物与RNA的比例。起始浓度范围为20μl体系50-250μg。 Oligo dT：适用于具有PolyA尾巴的RNA。（原核生物的RNA、真核生物的Oligo dT rRNA和tRNA不具有PolyA尾巴。）由于Oligo dT要结合到PolyA 尾巴上，所以对RNA样品的质量要求较高，即使有少量降解也 会使全长cDNA合成量大大减少。起始浓度范围为20μl体系0.2-0.5μg 基因特异性引物GSP：与目的序列互补的引物，是反义寡聚核苷酸，适用于目的序列已知的情况。如果目的RNA有二级结构，为避免二级结构阻止引物结合，应该设计多于一个的反义引物。建议在20ul的第一链合成反应体系中使用1pmol的基因特异性引物。 逆转录酶： 1、 Money鼠白血病病毒（M-MLV）反转录酶：有强的聚合酶活性，RNase H活性相对较弱。最适作用温度为37℃。 2、禽成髓细胞瘤病毒（AMV）反转录酶：有强的聚合酶活性和RNase H活性。最适作用温度为42℃。 3、Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶：在Mn2+存在下，允许高温反转录RNA，以消除RNA模板的二级结构。 4、M-MLV反转录酶的RNase H-突变体：商品名为SuperScript和SuperScriptⅡ。此种酶较其它酶能多将更大部分的RNA转换成cDNA，这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的mRNA模板合成较长cDNA。 一步法RT-PCR和两步法RT-PCR： RT-PCR可以通过一步法和两步法的形式进行：一步法即反转录和PCR扩增在同一管内完成，cDNA第一链合成和随后的PCR扩增之间不需要打开管盖，有助于减少污染。而且由于得到的所有cDNA样品都用来扩增，所以灵敏度更高，最低可以达到0.01pg总RNA。一步法RT-PCR一般使用基因特异性引物起始cDNA合成。两步法即反转录和PCR扩增分两步进行。首先从RNA模板反转录得到cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增。两步法可以使用随机引物、Oligo dT和基因特异性引物引导cDNA第一链合成，因此，可以从一个特定的样品中反转录出所有的mRNA的信息。总之，一步法方便，可适用于大量样品分析或定量PCR。两步法在选择聚合酶和引物时具有更大的灵活性。 一步法RT-PCR和两步法RT-PCR比较 两步法RT-PCR 一步法RT-PCR 所用引物 随机引物、Oligo dT和基因特异性引物 基因特异性引物 优点 PCR扩增失败时便于分析原因 特异性和灵敏度高，有助于减少污染 在选择聚合酶和引物时具有更大的灵活性 适用范围 检测多种目的基因半定量PCR 大量样品分析定量PCR 一步法RT-PCR反应流程 两步法RT-PCR反应流程 ...... mRNA 5' cDNA cDNA 3' 3' 5' 3' 5' 3' 5' AAAAAAAA Poly（A）尾 逆转录酶合成cDNA第一链 T T T T T T T T 灭活逆转录酶，同体系聚合酶作用 PCR扩增目的片段 mRNA 5' 3' 3' 5' AAAAAAAA Poly（A）尾 3' 5' mRNA AAAAAAAA cDNA T T T T cDNA T T T T ...... T T T T Oligo（dT） 逆转录酶合成cDNA第一链 以cDNA第一链为模板，进行PCR扩增 PCR扩增目的片段